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T7 High Yield Transcription Kit

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貨號:
M0k942118
產(chǎn)品規格:
50T
購買(mǎi)數量:
產(chǎn)品詳情 操作說(shuō)明 注意事項

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱(chēng)

規格

T7 High Yield

Transcription Kit

50T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

本試劑盒是利用T7 RNA Polymerase,以含有T7啟動(dòng)子的線(xiàn)性化質(zhì)粒DNA、PCR產(chǎn)物或合成的DNA為模板,以NTP為底物,在體外轉錄合成RNA。本試劑盒優(yōu)化了RNA體外轉錄反應體系,可以簡(jiǎn)單快速獲得大量的RNA分子,如果轉錄時(shí)在底物中加入修飾的核苷酸,可以制備生物素或染料標記的RNA。本試劑盒主要用于體外翻譯、RNase保護實(shí)驗、雜交探針標記、RNA剪切等生物實(shí)驗。在反應體系中1 μg的模板投入量可以產(chǎn)生大于100 μg的RNA,適用于制備長(cháng)度100-5000 nt的RNA。



儲存與運輸

冰袋(wet ice)運輸;-20℃保存,12個(gè)月有效。


組成

Component


T7 RNA Transcription Enzyme Mix

200 μL

5×T7 Transcription Reaction Buffer

250 μL

25 mM NTP Mix

100 μL

DNase I

50 μL

Nuclease Free Water

1 mL

Control Template (0.5 μg/μL)

10 μL

說(shuō)明書(shū)

1份


操作步驟

1. 模板準備:

a. 以T7啟動(dòng)子的質(zhì)粒為模板:為了得到特定長(cháng)度的RNA,質(zhì)粒模板必須完全線(xiàn)性化(需要純化后作為模板),且線(xiàn)性化的質(zhì)粒確保雙鏈為平末端或5’突出端(避免出現3’突出端),每個(gè)反應建議模板量為1 μg;

b. 以T7啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物或合成的DNA片段為模板:PCR擴增模板時(shí)將T7啟動(dòng)子(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)加到非編碼鏈引物的5‘端。PCR產(chǎn)物可以不經(jīng)純化直接作為轉錄模板,但純化后會(huì )產(chǎn)出更多的RNA,每個(gè)反應建議模板量為0.5 μg左右。

2. 轉錄反應:按照表格推薦反應體系在潔凈的EP管中加入各種試劑,充分混勻后于37℃反應2 h。(如合成小于300 nt的RNA,建議將反應時(shí)間延長(cháng)至4 h或更長(cháng)時(shí)間)。

Component

Volume

Template

0.5-1 μg

5×T7 Transcription Reaction Buffer

4 μL

25 mM NTP Mix

2 μL

T7 RNA Transcription Enzyme Mix

4 μL

Nuclease Free Water

To 20 μL

3. 反應完畢后向體系中加入1 μL DNase I,37℃反應15 min,消化轉錄的DNA模板。

4. 轉錄合成的RNA經(jīng)電泳分析、純化后,可用于下游實(shí)驗。

5. 轉錄產(chǎn)物定量、檢測:通過(guò)紫外吸收法可以測定RNA濃度(游離核苷酸會(huì )影響定量的準確性,RNA產(chǎn)物需要純化);電泳檢測推薦采用1%甲醛瓊脂糖變性膠檢測,電泳液為1×MOPS Buffer(10×MOPS Buffer:0.4 M MOPS,pH 7.0,0.1 M Sodium Acetate,10 mM EDTA)。凝膠制備方法:稱(chēng)取0.5 g瓊脂糖加入36 mL RNase-Free Water中,加熱溶化后,加入5 mL 10×MOPS Buffer。待溶液冷卻至不燙手時(shí),加入9 mL甲醛溶液(37%),混勻后倒膠。電泳檢測時(shí)取適量RNA與RNA Loading Buffer混合,70℃孵育10 min后冰浴2 min,全部點(diǎn)樣。電泳結束后用EB或SerRed染色觀(guān)察。


注意事項

1. 人體皮膚表面含有豐富的RNase,實(shí)驗時(shí)請帶好實(shí)驗手套、口罩,實(shí)驗耗材無(wú)菌無(wú)酶,防止RNase污染。

2. 如需制備標記RNA,請替換試劑盒中的NTP Mix。

3. 試劑盒中對照模板轉錄長(cháng)度為500 nt。

4. 為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

 

產(chǎn)品僅供科研用途,不用于臨床診斷!

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