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DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit

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貨號:
FKU0174
產(chǎn)品規格:
100T
購買(mǎi)數量:
產(chǎn)品詳情 操作說(shuō)明 注意事項

產(chǎn)品描述

細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的階段性過(guò)程。染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300 kb的大片段,然后大約30%的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴(lài)的核酸內切酶作用下,在核小體單位之間被隨機切斷,形成180-200 bp核小體DNA多聚體。因此在細胞凋亡晚期,DNA會(huì )被降解為180-200 bp的片段,斷裂的基因組DNA上暴露出大量的3'-OH末端。末端脫氧核糖核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)是一種不依賴(lài)于模板的DNA聚合酶,可以催化脫氧核苷酸結合到斷裂的DNA分子3'-OH末端。因此TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)細胞凋亡檢測試劑盒可以用來(lái)檢測組織細胞在凋亡晚期過(guò)程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是在TdT酶的作用下,在基因組DNA斷裂時(shí)暴露出的3′-OH末端摻入CF640-dUTP,從而可以用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測(CF640激發(fā)642 nm,發(fā)射662 nm)。本試劑盒應用范圍廣,適用于石蠟組織切片,冰凍組織切片、細胞爬片、細胞涂片等的細胞凋亡檢測。



儲存與運輸

冰袋(wet ice)運輸;

本試劑盒儲存在-20℃,CF488-dUTP Labeling Mix需避光儲存于-20℃,有效期12個(gè)月。



實(shí)驗前準備

1. PBS磷酸鹽緩沖液;

2. 固定液:溶于PBS的4%多聚甲醛,pH 7.4;

3. 破膜液:溶于0.1%檸檬酸鈉的0.1% Triton X-100;

4. 配制含2% Triton X-100的PBS;配制含1% Triton X-100及5 mg/mL BSA的PBS;

5. 如需染核,需自備DAPI(2 μg/mL)或PI(1 μg/mL);

6. 如需陽(yáng)性對照實(shí)驗,需自備DNase I;

7. 如果用流式細胞儀,自備PI染液和RNase A(DNase free);

8. 操作時(shí)請穿實(shí)驗服,佩戴一次性手套。

操作步驟

一、樣品準備

A. 石蠟包埋組織切片

1. 室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5-10 min,重復2-3次;然后無(wú)水乙醇浸泡5 min,重復2次;最后用梯度乙醇(85%、75%、雙蒸水)各浸泡1次,每次5 min;

2. 用PBS輕輕潤洗切片,并去掉樣本周?chē)嘤嘁后w,使用組化筆沿組織外圍輪廓畫(huà)一個(gè)與組織間隔2-3 mm的小圈,便于下游通透性處理和平衡標記操作,在實(shí)驗過(guò)程中,切勿讓樣品干燥,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤;

3. 配制Proteinase K工作液:按1:9的比例,用PBS作為稀釋液來(lái)稀釋Proteinase K(200 μg/mL)原液,使其終濃度為20 μg/mL;

4. 每個(gè)樣本上滴加100 μL上述Proteinase K工作液,使其被全部覆蓋,37℃孵育20 min;

(注:Proteinase K處理主要有助于組織和細胞后續步驟的染色試劑通透,其孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)過(guò)短都會(huì )影響后續標記效率,得到更好的結果,可以?xún)?yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間)

5. 用PBS溶液浸潤清洗樣本3次,每次5 min(Proteinase K需洗滌干凈,否則會(huì )干擾后續的標記反應)。處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤;

6. (可選步驟)去掉樣本上多余的液體,將適量破膜液滴加到組織上,充分浸潤組織,室溫處理20 min;破膜處理完成后同樣的用PBS溶液潤洗樣本3次,每次5 min;處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

B. 組織冰凍切片

1. 將玻片浸沒(méi)在4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)中固定,室溫下孵育10-15 min;

2. 片子從固定液中取出后,通風(fēng)櫥中自然晾干;

3. 將玻片放入純水或PBS中潤洗,去掉玻片上殘存的固定液;

4. 用組化筆沿著(zhù)組織外圍輪廓畫(huà)一個(gè)與組織間隔2-3 mm的小圈,便于下游通透性處理和平衡標記操作;在實(shí)驗過(guò)程中,切勿讓樣品干燥,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤;

5. 配制Proteinase K工作液:按1:9的比例,用PBS作為稀釋液來(lái)稀釋Proteinase K(200 μg/mL)原液,使其終濃度為20 μg/mL;

6. 每個(gè)樣本上滴加100 μL上述Proteinase K工作液,使其被全部覆蓋,室溫孵育10 min;

(注:Proteinase K處理主要有助于組織和細胞后續步驟的染色試劑通透。其孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)過(guò)短都會(huì )影響后續標記效率;未得到更好的結果,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間)

7. 用PBS溶液潤洗樣本2-3次,去掉多余液體(Proteinase K需洗滌干凈,否則會(huì )干擾后續的標記反應),處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤;

8. (可選步驟)將適量破膜液滴加到組織上,充分浸潤組織,室溫處理20 min,破膜處理完成后同樣的用PBS溶液潤洗樣本,去掉多余液體,處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

C. 細胞爬片

1. 在Lab-Tek載玻片小室(Chamber Slides)上培養貼壁細胞,在凋亡誘導處理之后,用PBS輕輕潤洗2遍載玻片;

2. 向每個(gè)載玻片小室中加入適量的4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)固定,室溫下孵育20 min;

3. 去掉固定液,加入PBS清洗3次,每次5 min;

4. 每個(gè)樣本浸于破膜液中,室溫孵育5 min進(jìn)行通透處理;

5. 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒(méi)清洗樣本2-3次;

6. 輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w。處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

D. 細胞涂片

1. 以約2×107個(gè)細胞/mL的濃度將細胞重懸于PBS中,吸取50-100 μL細胞懸液滴于防脫玻片上,使用一片潔凈的載玻片輕柔涂開(kāi)細胞懸液;

2. 將玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中,固定細胞,在4℃放置25 min;

3. 將玻片浸入PBS中,室溫放置5 min浸洗,重復一次;

4. 輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周?chē)嘤嗟囊后w,用組化筆沿著(zhù)細胞外圍輪廓畫(huà)一個(gè)小圈,便于下游透性處理和平衡標記操作,在實(shí)驗過(guò)程中,切勿讓樣品干燥;

5. 每個(gè)樣本浸于破膜液中,室溫孵育5 min進(jìn)行通透處理;

6. 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒(méi)清洗樣本2-3次;

7. 輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w。處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。


二、DNase I處理陽(yáng)性對照實(shí)驗(可選步驟)

在樣本通透處理后,用DNase I處理樣本來(lái)準備陽(yáng)性對照。

1. 將100 μL 1×DNase I Buffer(配制方法:取10 μL 10×DNase I Buffer,然后加入90 μL去離子水混勻)滴加到已通透的樣本上,室溫孵育5 min;

2. 輕輕去掉多余液體,加入100 μL含有DNase I(20 U/mL)的工作液(配制方法:取10 μL 10×DNase I Buffer,然后加入2 μL DNase I,再加入88 μL去離子水混勻),室溫孵育10 min;

3. 輕輕去掉多余的液體,并將載玻片在裝有PBS的染色缸中徹底洗3-4次。

(注:陽(yáng)性對照載玻片必須使用單獨的染色缸,否則陽(yáng)性對照載玻片上殘留的DNase I可能會(huì )在實(shí)驗載玻片上引入高背景)



三、標記與檢測

1. 平衡:每個(gè)樣本滴加50 μL Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區域,室溫孵育10 min;

2. 標記液配制:在冰上解凍CF488-dUTP Labeling Mix和Equilibration Buffer,并按照Recombinant TdT enzyme:CF488-dUTP Labeling Mix:Equilibration Buffer=1 μL:5 μL:50 μL(1:5:50)比例混合足夠用于所有實(shí)驗的TdT孵育緩沖液,具體實(shí)驗使用試劑的體積可以根據玻片的大小進(jìn)行適當等比例調整;

3. 陰性對照體系:準備一份不含Recombinant TdT enzyme的對照TdT孵育緩沖液,用ddH2O替代;

4. 標記:盡量去掉平衡的Equilibration Buffer,然后在每份組織樣本上加入56 μL TdT孵育緩沖液,在37℃孵育1 h;注意不能干片,載玻片要避光;

5. 立即用PBS潤洗組織樣本,清洗4次,每次5 min;

6. 用濾紙輕輕擦掉樣本周?chē)腜BS溶液;

7. 核染色:樣本在染色缸中染色,在黑暗中將載玻片浸入裝有DAPI溶液(用PBS新鮮配制并稀釋?zhuān)┑娜旧?,室溫放? min;

8. 封片:樣本染色完成后,用PBS清洗組織樣本3次,每次5 min,然后輕輕去掉多余液體,滴加抗熒光淬滅封片劑封片;

9. 鏡檢:立即在熒光顯微鏡下分析樣本,載玻片注意避光,DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成藍色,只在凋亡的細胞核中才有CF488-dUTP摻入而定位的綠色熒光。


四、利用流式細胞術(shù)檢測懸浮細胞

1. 將待檢測細胞用PBS清洗兩次,4℃離心(500 g)然后重懸在500 μL PBS中;

2. 固定:向樣品中加入5 mL 1%用PBS配制的多聚甲醛溶液,固定細胞,冰上放置20 min;

3. 細胞在4℃,300 g離心10 min,去上清并用5 mL PBS重懸兩次,最后用500 μL PBS重懸細胞;

4. 通透:向樣品中加入5 mL冰上預冷的70%乙醇,-20℃孵育4 h,通透細胞;

(注:細胞也可用破膜液室溫5 min進(jìn)行通透

5. 細胞用300 g離心10 min后用5 mL PBS重懸,再次離心后用1 mL PBS 重懸;

6. 平衡:轉移約2×106個(gè)細胞至1.5 mL的微量離心管,300 g離心10 min,去上清,并用80 μL Equilibration Buffer重懸,室溫孵育5 min;

7. 標記液配制:在冰上解凍CF488-dUTP Labeling Mix和Equilibration Buffer,并按照Recombinant TdT enzyme:CF488-dUTP Labeling Mix:Equilibration Buffer=1 μL:5 μL:50 μL(1:5:50)比例混合足夠用于所有實(shí)驗和可選陽(yáng)性對照反應的TdT孵育緩沖液;

8. 標記:細胞用300 g離心10 min,去上清將沉淀重懸在56 μL TdT孵育緩沖液中,37℃孵育1 h,避光。每隔15 min用微量移液器輕輕重懸細胞;

9. 反應完成后加入1 mL 20 mM EDTA終止反應,用微量移液器輕柔混勻;

10. 300 g離心10 min,去上清并將沉淀重懸在1 mL破膜液中,其中含5 mg/mL BSA,重復洗2次;

11. 核染色:300 g離心10 min,去上清并將細胞沉淀重懸在0.5 mL DAPI溶液中,其中包含250 μg無(wú)DNA酶的RNase A,在黑暗中室溫孵育細胞30 min;

12. 上機檢測:流式細胞儀分析細胞,DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞均染成藍色,只在凋亡的細胞核中才有CF488-dUTP摻入而定位的綠色熒光。


五、實(shí)驗流程簡(jiǎn)圖



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